Kamis, 10 Mei 2012

Isolasi Protein Hewan dan Tumbuhan


LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI PROTEIN HEWAN DAN TUMBUHAN


Pelaksanaan Praktikum : Jum’at 16 Maret 2012



Disusun oleh:

1.      Syaiful Yahya                                    (081014072)
2.      Sri Wahyuni                                       (081014109)
3.      Salwa Hayati                                     (081014095)
4.      Siti Nur Hafidah                                (081014104)
5.      Syarif Maturindo                               (081014115)                                                   

Dosen yang Asistensi:
 Sri Puji Astuti

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2012

       I.            TUJUAN

1.      Mengisolasi protein dari organ hati (ayam, mencit, dan sapi), organ limpa dan  jantung mencit
2.      Mengisolasi protein dari daun muda (ujung), setengah muda (tengah), daun tua (pangkal), serta batang tanaman
3.      Mengukur konsentrasi protein hewan dan tumbuhan hasil isolasi.


    II.            DASAR TEORI

Protein (protos yang berarti ”paling utama”) adalah senyawa organik kompleks yang mempuyai bobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida.  Peptida dan protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil. Jika bobot molekul senyawa lebih kecil dari 6.000, biasanya digolongkan sebagai polipeptida.
Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi oleh manusia. Seperti pada tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya. Secara umum, sumber dari protein adalah dari sumber nabati dan hewani. Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh.

Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada protein.
Dari struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat.
Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik yang melibatkan gugus R-nya.
Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut : asam amino non-polar dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Prolin, Fenilalanin, Triptofan dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan Lisin, Serin, Treonin, Sistein, Tirosin, Asparagin dan Glutamin. Golongan ketiga yaitu asam amino yang bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino yang bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai delapan macam asam amino esensial yaitu valin, leusin, Isoleusin, metionin, Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya.
Protein tersusun atas asam-asam amino melalui ikatan peptide, yaitu ikatan antara gugus karboksil (-COOH) dan gugus amina (-NH2). Oleh karena itu protein juga disebut polipeptida.
Ikatan yang terjadi pada protein selain ikatan peptide antar asam-asam amino penyusunnya, juga terjadi ikatan-ikatan yang lain. Misalnya, ikatan hydrogen yang terjadi pada gugus N-H dan pada gugus O-H, ikatan disulfide yaitu –S – S – menyokong terjadinya ikatan yang kompleks pada protein. Ikatan ion pada protein juga terjadi bila di dalamnya terdapat gugus ion logam, dan ikatan koordinasi, misalnya ikatan koordinasi antara ion Fe3+ dengan hemoglobin pada darah.
Protein :
H2O H+
{ – NHCHC – NHCHC – }              H2NCHCO2H  +  H2NCHCO2H  +  ………………..
R              R                Kalor                  R                         R
Sifat-sifat protein :
a)      Protein sukar larut dalam air Karen ukuran molekulnya yang sangat besar.
b)      Dapat mengalami koagulasi oleh pemanasan, penambahan asam atau basa.
c)      Bersifat amfoter karena membentuk zwitter ion, pada titik isoelektriknya protein mengalami koagulasi sehingga dapat dipisahkan dari pelarutnya.
d)     Protein dapat mengalami kerusakan (terdenaturasi) oleh pemanasan. Pada denaturasi protein dapat mengalami kerusakan mulai dari kerusakan struktur primernya sampai pada struktur tersiernya.
Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsinya, setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milie. Protein yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya.

Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur fraksinasi sel yaitu :
·         Memisahkan sel dari jaringannya.
·         Menghancurkan membrane sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan organelnya.
·         Memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya.

Isolasi protein yaitu memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein dengan sifat tertentu dan protein dari protein lain lain yang tidak diinginkan dalam analisa. Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan aktifitasnya tidak berubah. Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki daya pemisah terendah seperti pengendapan dengan ammonium sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi olah berbagai factor antara lain jumlah dan posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperature larutan.


 III.            ALAT DAN BAHAN
Bahan:
-          Hati (ayam,mencit, dan sapi),limpa dan jantung mencit
-          Daun muda, daun tengah, dan daun tua, serta batang tumbuhan
-          Buffer ekstrak (Tris HCL 0,1 M pH 7,2 dan mercaptoehanol
-          Larutan Bradford
-          Akuades
-          Es
-          Etanol dingin
Alat
-          Mortal dan pestle
-          Tabung Eppendorf
-          Refrigerator
-          Micro pippet
-          Shaker
-          Tip: blue tip, yellow tip, white tip.
-          Sentrifus
-          Microcuvet
-          Spektrofotometer
-          Kulkas



 IV.            CARA KERJA

Isolasi Protein Hewan
1.      Memotong kecil- kecil organ hati, limpa, dan jantung sebanyak 1 gram. Kemudian menggerusnya dengan mortal dan pastle dalam keadaan dingin (pemecahan secara mekanik) sambil menambahkan dengan buffer ekstraksi sebanyak 300- 500 μl (pemecahan secara kimiawi)
2.      Memasukkan homogenate kedalam tabung Eppendorf, dan di vorteks selama 10 menit. Dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit.
3.      Memisahkan antara supernatan dan peletnya.
4.      Mengambil supernatannya dan menambahkan dengan etanol absolut dingin dengan perbandingan 1:1.setelah itu menginkubasi dalam refrigerator selama 1 jam pada suhu 4o C untuk pemisahan etanol dan proteinnya
5.      Mensentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 10.000 rpm
6.      Mengambil endapan dan mengeringkan hingga bau etanol hilang,serta menambahkan buffer Tris-HCL 20 mM sebanyak 100 μl untuk penyangga agar protein tetap pada kondisi tersebut. Setelah proses tersebut akan mendapatkan ekstrak protein kasar.
7.      Mengukur kadar protein hasil ekstraksi.pertama membuat larutan blanko yang terdiri dari 200 μl larutan Bradford dan ditambah 800 μl akuades. Kedua membuat larutan sampel yang terdiri dari 10 μl protein sampel hasil isolasidan 200 μl larutan Bradford, serta ditambah 790 μl akuades.
8.      Mengukur nilai OD protein sampel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
9.      Menghitung konsentrasi protein dengan rumus Y= 0,0465 X – 0,0157 ( Y adalah nilai OD, X adalah konsetrasi protein).
10.  Supernatan disimpan dalam refrigerator -20% sampai dilakukan elektroforesis

Isolasi Protein Tumbuhan
1.      Menghancurkan daun sebanyak 0,1 gram dengan mortal dan pestle.
2.      Memindahkan homogenate yang dihasilkan ke tabung Eppendorf dan menambahkan sebanyak 300- 500 μl buffer ekstrak dalam keadaan dingin.
3.      Menginkubasikan homogenate dalam refrigerator selama 30 menit dengan dishaker sekali selama 10 menit.
4.      Mensentrifugasi homogenat pada 7.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4oC. Supernatan yang didapatkan  dipindahkan ke tabung Eppendorf baru. Supernatan yang didapatkan sudah mengandung protein kasar.
5.      Mengukur konsentrasi protein hasil ekstraksi dengan cara yang sama  pada pengukuran konsentrasi protein hewan (langkah 7-9)
6.      Menyimpan supernatan dalam refrigerator -20o C sampai dilakukan elektroforesis




    V.            HASIL PENGAMATAN
Bahan
OD
Konsentrasi Protein
Hati Mencit
0,396
0,8853 µg/µl
Hati Sapi
0,106
0,1308 µg/µl
Hati Ayam
0,3
0,679 µg/µl
Organ Limpa
0,054
0,15 µg/µl
Jantung
0,057
0,156 µg/µl
Daun Muda
0,187
0,4359 µg/µl
Daun Setengah Muda
0,530
1,1735 µg/µl
Daun Tua
0,235
0,5391 µg/µl
Batang
0,136
0,3262 µg/µl

Menghitung Konsentrasi Protein dengan Rumus :
Y = 0,0465 X – 0,0157
Keterangan :
Y : nilai OD
X : konsentrasi protein

 VI.            PEMBAHASAN
A.    Isolasi protein hewan
            Langkah pertama yang dilakukan adalah menimbang bahan-bahan sebanyak 1 gram, kemudian digerus dan ditambahkan dengan buffer ekstraksi sebanyak 300-500 ul. Penambahan buffer ekstraksi bertujuan untuk memecahkan sel- sel yang terdapat dalam bahan. Langkah selanjutnya adalah menghomogenkan campuran dengan vortex kemudian disentrifugasi 6000 rpm untuk  memisahkan rendemen (pelet) dari supernatan. Supernatan diambil kemudian ditambahkan etanol dengan tujuan mengendapkan protein, selanjutnya supernatan di sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm. Endapan yang diambil dari proses sentrifugasi ditambahkan buffer Tris HCL 20 mM untuk menyangga agar protein tetap pada kondisi pH yang sesuai.

            Pengukuran kadar protein hasil ekstraksi dilakukan dengan cara membuat larutan blanko yang terdiri dari 200 ul Larutan Bradford dan 800 ul aquades. Larutan Bradford merupakan senyawa indikator adanya protein. kemudian dilakukan pembuatan larutan sampel yang terdiri atas 10 ul protein, 200 ul Bradford dan 790 ul aquades.Langkah selanjutnya dilakukan pengukuran OD mengunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.

            Kadar protein yang diketahui berupa nilai kekeruhan larutan. Nilai- nilai OD pada masing-masing bahan dikonversikan dalam satuan M (molaritas) Menggunakan Rumus Y= 0,0465X – 0,0157. Dengan demikian dihasilkan konsentrasi protein pada masing- masing bahan yakni: Organ Limpa Mencit sebesar 0,15 µg/µl dan Organ jantung mencit sebesar 0,156 µg/µl

Isolasi protein Tumbuhan
            Pada dasarnya langkah- langkah isolasi protein tumbuhan samahalnya dengan isolasi pada tumbuhan, namun pada isolasi protein tumbuhan hanya dilakukan sentrifugasi 1 X dengan kecepatan 7.000 rpm. Selain itu untuk mendapatkan protein kasar tumbuhan tidak mengambil peletnya, akan tetapi mengambil supernatannya karna pada supernatan inilah yang mengandung protein. Larutan sampel yang diambil sebanyak 10 ul diukur nilai OD nya dengan spektrofotometer  dengan panjang gelombang 565 nm. Kemudian nilai OD dikonversikan dalam satuan Molar Menggunakan Rumus Y= 0,0465X – 0,0157. Dengan demikian dihasilkan konsentrasi protein pada masing- masing bahan yakni: Batang Tumbuhan sebesar 0,3262 µg/µl.

VII.            KESIMPULAN
1.      Konsentrasi protein pada organ limpa mencit adalah 0,15 µg/µl
2.      Konsentrasi protein pada organ jantung mencit adalah 0,156 µg/µl
3.      Konsentrasi protein pada batang tumbuhan adalah 0,3262 µg/µl.
4.      Urutan konsentrasi protein dari ketika pengamatan tersebut dari konsentrasi rendah ke tinggi adalah, Organ limpa mencit, organ jantung mencit dan batang tumbuhan
5.      Konsentrasi protein untuk tiap organ atau spesies jelas berbeda ,hal ini tergantung pada fungsinya.

VIII.            DAFTAR PUSTAKA
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs: xvi + 779 hlm.
Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.
Raven, P.H. & G.B. Johnson. 2002. Biology. 6th ed. McGraw-Hill Companies, Inc., New York: xxiv + 1238 hlm.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar

terima kasih atas komentarnya mudah-mudahan bermanfaat