Sabtu, 16 Juni 2012

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA MOLEKULER ISOLASI DNA HEWAN

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI DNA HEWAN


Pelaksanaan Praktikum : Jum’at 11 Mei  2012



Disusun oleh:

1.      Syaiful Yahya                                                (081014072)
2.      Sri Wahyuni                                       (081014109)
3.      Salwa Hayati                                     (081014095)
4.      Siti Nur Hafidah                                (081014104)
5.      Syarif Maturindo                               (081014115)                                                   

Dosen yang Asistensi:
 Sri Puji Astuti

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2012


I.         TUJUAN UMUM
Melatih ketrampilan mahasiswa dalam mengisolasi DNA

II.      DASAR TEORI
            Komponen utama kromosom organisme eukariota adalah DNA dan protein histon. DNA bersifat asam sedangkan protein histon bersifat basa. DNA merupakan bahan genetik sebab informasi biologi terkandung di dalamnya. DNA terdiri dari gula pentosa (Dioksirobosa), asam fosfat dan pasangan basa nitrogen (purin dan pirimidin). DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom. 

A.    Isolasi DNA kromosom
            DNA pada prinsipnya dapat diisolasi dari berbagai sumber, anatara lain darah, organ tubuh, daging, serangga, daun dan sebagainya. Pada individu yang sama, DNA yang diperoleh dari berbagai sumber, akan memiliki jenis, jumlah dan ukuran yang sama. Untuk memperoleh isolat DNA dari sampel, ada beberapa hal yang perlu diperhatikan yaitu :
1.      Pemecahan dinding sel dan membran inti , dapat dilakukan dengan 2 cara :
a.       Secara fisik, yaitu pemecahan sel dengan cara resonansi atau kekuatan mekanik
b.      Secara kimia, yaitu dengan cara buffer lisis yang dapat merusak integritas barier dinding dan membran sel, contohnya lisosim, EDTA, Tris-Hcl, SDS
2.      Pemisahan larutan DNA dari debris dengan cara centrifuge
3.      Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA yang murni menggunakan proteinase-K atau RNAse
4.      Presipitasi DNA dengan etanol yang dingin
5.      Pemurnian DNA dari ekstrak sel, dapat menggunakan larutan fenol, isopropanol.
6.      Melarutkan pelet DNA dengan buffer TE normal ddH2O

B.     Isolasi DNA plasmid
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol. 

Isolasi DNA darah bisa menggunakan protokol FBI. Sapel darah yang telah dibekukan pada suhu -700 C pada EDTA vacutainer tubes dicairkan, setelah itu ditambahkan sitrate buffer standart ditambah, dicampur dan tabung disentrifuse. Supernatanya dibuang, dan penambahan buffer ditingkatkan, dicampur dan disentrifus lagi. Setelah supernatan dibuang, pelet dilarutkan kembali pada larutan detergent SDS dan proteinase K, dan campuran diinkubasi pada 55C selama satu jam. Sampel kemudian diekstrak fenol sekali dengan menggunakan phenol/chloroform/isoamyl alcohol solution.Setelah sentrifugasi, lapisan berair dibersihkan dari tabung mikrosentrifuse. DNA merupakan precipitate dari ethanol, dilarutkan kembali pada buffer kemudian dipresipitasi dua kali. Pertama kali pengeringan pelet, buffer ditambah dan DNA diinkubasi pada suhu 550 C semalaman, larutan DNA diuji dengan menggunakan polymerase chain reaction.
C.     Isolasi RNA 
RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA
Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.

Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf.
Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu sampel darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Setelah disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas merupakan serum, lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil dengan klinipette.

Isolasi DNA darah bisa menggunakan protokol FBI. Sapel darah yang telah dibekukan pada suhu -700 C pada EDTA vacutainer tubes dicairkan, setelah itu ditambahkan sitrate buffer standart ditambah, dicampur dan tabung disentrifuse. Supernatanya dibuang, dan penambahan buffer ditingkatkan, dicampur dan disentrifus lagi. Setelah supernatan dibuang, pelet dilarutkan kembali pada larutan detergent SDS dan proteinase K, dan campuran diinkubasi pada 55C selama satu jam. Sampel kemudian diekstrak fenol sekali dengan menggunakan phenol/chloroform/isoamyl alcohol solution.Setelah sentrifugasi, lapisan berair dibersihkan dari tabung mikrosentrifuse. DNA merupakan precipitate dari ethanol, dilarutkan kembali pada buffer kemudian dipresipitasi dua kali. Pertama kali pengeringan pelet, buffer ditambah dan DNA diinkubasi pada suhu 550 C semalaman, larutan DNA diuji dengan menggunakan polymerase chain reaction.

III.   BAHAN DAN ALAT KERJA
·         BAHAN
1)      Sampel daraah manusia (2-3 ml)
2)      Buffer lisis eritrosit (8,2 g NH4Cl pH 7,5 ; 1g KHCO3; 37 mg EDTA dalam 1 L)
3)      Buffer TE lisis (20 mM Tris dan 5 mM EDTA pH 7,5)
4)      Normal TE (10 mM Tris dan 1 mM EDTA)
5)       6 M NaCl (larutkan sedikit demi sedikit NaCl saat membuat larutan ini)
6)      Proteinase K (10 mg/ml)
7)      10% SDS

·         ALAT
1)      Mikropipet dan tip dalam berbagai ukuran
2)      Tabung Polipropilen/falcon (centrifuge tube) 15 ml dan tabung eppendorf
3)      Centrifuge dan waterbath

IV.   CARA KERJA
A.    Isolasi DNA Darah
1)      Memasukkan 3 ml darah ke dalam tabung polipropilen atau tabung falcon yang telah diberi antikoagulan EDTA lalu dihomogenisasikan
2)      Menambahkan 3 ml buffer lisis eritrosit (perbandingan 1:1) dan membiarkan 5-10 menit pada  4OC
3)      Mensentrifugasi 2.500-3.000 rpm dalam suhu ruang selama 5-10 menit
4)      Membuang supernatan pelan-pelan tetapi jangan sampai mengganggu pelet. Bila pelet masih berwarna merah, mengulangi langkah 2 dan 3 sampai didapatkan pelet putih. Pelet yang merah menunjukkan maih adanya sel darah merah, sedangkan pelet putih menunjukkan sel limfosit.
5)      Menambahkan 800 μl TE lisis (cell lysis solution) ke dalam pelet putih dan meresuspensi sampai homogen dengan cara pipeting
6)      Menambahkan 15 μl Proteinase-K dan 40 μl 10% SDS, lalu meresuspend dan memindahakan ke dalam tabung polipropilen steril
7)      Memasukkan tabung ke dalam waterbath 50OC selama 1 jam
8)      Mengambil tabung dari waterbath dan membiarkan sampai dingin pada temperatur kamar
B.     Presipitasi DNA
1)      Menambahkan 6 M NaCl sebanyak 1/3 volume hasil kerja diatas dan me-resuspend sampai menjadi homogen sehingga terlihat pemisahan warna larutan
2)      Mensentrifugasi 2500 rpm selama 15-20 menit sehinggan terbentuk pelet garam warna putih
3)      Mengambil supernatan dan memindahkannya ke tabung polipropilen baru
4)      Menambahkan 2x volume etanol absolut (tergantung hasil kerja di atas) dan membolak-balik tabung perlahan-lahan sehingga tampak benang DNA putih melayang di permukaan supernatan
5)      Mensentrifugasi kecepatan 2.500 rpm selama 10 menit dan membuang supernatan hati-hati
6)      Mengambil benang DNA dengan ujung tip pipet  dan melarutkan pelet DNA dalam 100-200 μl buffer TE normal ke dalam tabung eppendorf dan kemudian disimpan pada suhu 4OC, atau langsung melakukan elektroforesis.


V.      HASIL PENGAMATAN
Perlakuan
Hasil Pengamatan
3 ml darah + antikoagulan EDTA dihomogenisasikan + 3ml buffer lisis
Lapisan atas = larutan berwarna merah
Lapisan bawah = terbentuk endapan merah kehitaman
Disentrifugasi ( 4x yang dilakukan dalam percobaan)
Terbentuk pelet warna putih
Pelet putih + 800 μl TE lisis dan dihomogenkan

Ditambah 15 μl Proteinase-K + 40 μl 10%SDS
Larutan kental (memekat) berwarna bening
Tabung di waterbath selama 1 jam
Larutan bening
Ke dalam tabung ditambahkan 6 M NaCl dan diresuspend
Bagian atas : warna kuning keruh
Bagian atas : supernatan bening
Disentrifugasi 2.500 rpm selama 15-20 menit
Terbentuk pelet garam warna putih
Supernatan + 2x volume etanol absolut
Terbentuk gumpalan benang DNA putih melayang dipermukaan supernatan
Benang/pelet DNA + 100-200 μl buffer TE normal
Pelet DNA larut



















VI.   PEMBAHASAN
Pada praktikum isolasi DNA hewan bertujuan untuk melatih keterampilan mahasiswa dalam mengisolasi DNA darah manusia. DNA merupakan bahan genetik sebab informasi biologi terkandung didalamnya, dalam mengisolasi DNA darah manusia ada beberapa langkah kerja yang harus dilakukan, pertama mengambil sampel darah manusia,dalam praktikum ini kelompok kami memakai  sampel darah milik Fida sebanyak 3 ml, kemudian  memasukkan 3ml darah ketabung polipropilen atau tabung falcon yang telah diberi antikoagulan EDTA lalu dihomogenisasikan, EDTA ini berfungsi sebagai perusak sel dengan cara menikat ion Mg (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease). Selanjutnya menambahkan 3 ml buffer lisis eritrosis (perbandingan 1:1) dan membiarkan 5-10 menit pada 4o C. Pada tahapan ini ini termasuk dalam pemecahan dinding sel dan membran inti secara kimiawi. Setelah itu mensentrifugasi 2.500- 3.000 rpm dalam suhu ruang selama 5- 10 menit. Tahapan ini ini termasuk dalam pemecahan dinding sel dan membran inti secara fisik. Langkah selanjutnya membuang supernatan pelan- pelan tetapi jangan sampai mengganggu pelet.Bila pelet masih berwarna merah menunjukkan masih adanya sel darah merah, sedangkan pelet putih menunjukkan sel limfosit. Selanjutnya menambahkan 800 μl TE lisis kedalam pelet putih dan meresuspensi sampai homogen dengan cara pipeting. Setelah itu menambahkan 15 ul protenase-K dan 40 μl  10 % SDS, lalu meresuspen dan memindahkan ke dalam tabung polypropilen steril. Disini protense-K berfungsi untuk denaturasi protein pada jaringan, sedangkan SDS merupakan deterjen yang berfungsi merusak dinding atau membran sel dan mendenaturasi protein. Kemudian memasukkan tabung ke dalam waterbath 50o selama 1 jam. Mengambil tabung dari waterbath dan membiarkan sampai dingin pada temperatur kamar. Langkah selanjutnya adalah presitipasi DNA atau proses pengendapan DNA, dengan menambahkan     6 M NaCI sebanyak 1/3 volume hasil kerja diatas dan meresuspen sampai menjadi homogen sehingga terlihat pemisahan warna larutan. Penambahan NaCI berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu di campur dengan etanol.  Kemudian mensentrifugasi 2500 rpm selama 15-20 menit sehingga terbentuk pelet garam warna putih. Langkah selanjutnya mengambil supernatan dan memindahkannya ke tabung propilen baru, kemudian menambahkan 2x volume etanol absolut dan membolak-balik tabung sehingga tampak benang DNA putih melayang di permukaan supernatan. Pemberian etanol berfungsi untuk memisahkan molekul-molekul nukleotida dari protein yang mungkin masih ada. Pada langkah ini kelompol kami berhasil mendapatkan DNA putih yang melayang di permukaan supernatan. Kemudian mensentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 10 menit dan membuang supernatan hati-hati. Selanjutnya mengambil benang DNA dengan ujung tip pipet dan melarutkan pelet DNA dalam 100 – 200 μl buffer TE normal ke dalam tabung eppendorf dan kemudian disimpan pada suhu 4oC. Untuk selanjutnya digunakan untuk elektroforesis pada praktikum yang akan datang.
VII.KESIMPULAN
DNA pada sample darah dapat diisolasi dengan cara merusak dinding sel, mendenaturasi protein dan mensentrifugasi.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., Johnson, A., J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the cell fifth edition. Pdf edition
Irawan, Bambang. Dkk. 2012. Petunjuk Praktikum Genetika Molekuler


Tidak ada komentar:

Poskan Komentar

terima kasih atas komentarnya mudah-mudahan bermanfaat